1. Les cellules à cryoconserver doivent être dans un bon état de croissance (phase logarithmique) et un taux de survie élevé, avec une densité d'environ 80 à 90 %.
2. Vérifiez si les cellules conservent toujours leurs propriétés uniques avant de les congeler.
Par exemple, l'hybridome doit être testé pour la production d'anticorps un à deux jours avant la cryoconservation.
3. Faites attention à la qualité du cryoprotecteur.
Le DMSO doit être de qualité réactif, stérile et incolore (filtré avec du Telflon FGLP de 0,22 micron ou des produits stériles achetés directement, tels que Sigma D-2650), aliquoté en petits volumes de 5 à 10 ml, conservé à 4 oC dans l'obscurité. Ne pas décongeler plusieurs fois. Le glycérol doit également être de qualité réactif et stocké dans l'obscurité après l'autoclavage. À utiliser dans l'année suivant l'ouverture, car il sera toxique pour les cellules après un stockage à long terme.
4. Concentration cellulaire pour la cryoconservation :
(1) Fibroblaste humain normal : 1~3 x 106 cellules/ml
(2) Hybridome : 1 ~ 3 x 106 cellules/ml, la concentration cellulaire ne doit pas être trop élevée, certains hybridomes mourront après décongélation 24 heures en raison de la concentration élevée de congélation.
(3) Lignées tumorales adhérentes : 5~7 x 106, selon le type de cellule. L'adénocarcinome nécessite une concentration plus élevée après décongélation, tandis que HeLa n'a besoin que de 1 à 3 x 106 cellules/ml.
(4) autres suspensions : 5~10 x 106 cellules/ml, les lymphocytes humains doivent être au moins 5 x 106 cellules/ml.
5. La concentration de cryoprotecteur est de 5 ou 10 % de DMSO. Si les conditions de congélation des cellules sont incertaines, une culture de secours doit être utilisée pendant la cryoconservation pour éviter une défaillance de congélation.
6. Méthode de congélation :
(1) Méthode traditionnelle : 4 oC 10 minutes ---> -20 oC 30 minutes ---> -80 oC 16-18 heures (ou toute la nuit) ---> Stockage à long terme dans la phase vapeur du réservoir d'azote liquide .
(2) Refroidissement programmé : utilisez une machine de refroidissement à vitesse constante pour réduire la température ambiante à -120 oC à une vitesse de -1 ~ -3 oC/min, et stockez-la dans la phase vapeur d'un réservoir d'azote liquide pendant longtemps. stockage à terme. Il convient à la conservation des cellules en suspension et des hybridomes.
7. Matériel :
(1) Cellules cultivées qui poussent bien
(2) Milieu frais
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Tube de cryoconservation en plastique stérile (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4 % p/v de bleu trypan (GibcoBRL 15250-061)
(6) Plaque d'hémocytomètre et couvercle en verre
(7) Machine de refroidissement à vitesse constante (KRYO 10 série II)
8. Étapes :
(1) Changez la moitié ou la quantité totale de milieu un jour avant la congélation et observez la croissance cellulaire.
(2) Préparation de la solution de cryoconservation (préparation avant utilisation) : ajouter du DMSO au milieu frais, la concentration finale est de 5 à 10 %, bien mélanger et la mettre à température ambiante pour une utilisation ultérieure.
(3) Selon le fonctionnement de la sous-culture cellulaire, collecter les cellules cultivées et prélever une petite quantité de suspension cellulaire (environ 0,1 ml) pour compter la concentration cellulaire et le taux de survie avant congélation.
(4) Centrifuger, retirer le surnageant, ajouter une quantité appropriée de solution de cryoconservation pour obtenir une concentration cellulaire de 1 à 5 x 106 cellules/ml, bien mélanger et distribuer dans le tube de cryoconservation étiqueté, 1 ml/flacon, et prendre une petite quantité de suspension cellulaire pour la détection de la contamination.
(5) Méthode de cryoconservation 1 : Le cryotube est placé à 4 oC pendant 10 minutes → -20 oC pendant 30 minutes → -80 oC pendant 16 à 18 heures (ou toute la nuit) → phase vapeur du réservoir d'azote liquide pour un stockage à long terme.
(6) Méthode de stockage par congélation 2 : Le tube de congélation est placé dans une machine de refroidissement à vitesse constante avec un programme défini, puis placé dans un réservoir d'azote liquide.
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